チャレンジは特殊な条件下でプレイするモードです。
各チャレンジをクリアすると新アイテムがアンロックされます。
各チャレンジをクリアすると新アイテムがアンロックされます。
| № | チャレンジ名 | チャレンジ内容 | 使用キャラクター | ゴール | 報酬 | チャレンジ解禁条件 |
| 1 | Pitch Black | ライフの量を確認することが出来ない＆全ての部屋が暗くなる。 トレジャールームあり。ショップは無し。 |
Isaac | Mom | Rune of Hagalaz | なし |
| 2 | High Brow | Number One, E. Coli, Butt Bombs, Flush!, Petrified Poopを所持して開始。 | Isaac | Mom | Rune of Jera | なし |
| 3 | Head Trauma | Tiny Planet, Soy Milk, Small Rock, Iron Barを所持して開始。 | Isaac | Mom | Rune of Ehwaz | なし |
| 4 | Darkness Falls | Pentagram, Dead Bird, Whore Of Babylon, Razor Blade, Sacrificial Dagger, Dark Matterを所持して開始。 | Eve | Satan | Rune of Dagaz | It Livesをアンロック |
| 5 | The Tank | Lard, Infamy, Yum Heart, Thunder Thighsを所持して開始。 | Magdalene | Mom | Rune of Ansuz | Magdaleneをアンロック |
| 6 | Solar System | Transcendence, Distant Admiration, Forever Alone, Halo of Fliesを所持して開始。 射撃禁止。 Lord of the Fliesの状態で開始。 |
Mom's heart | Rune of Perthro | Transcendenceをアンロック | |
| 7 | Suicide King | Ipecac, Mr. Mega, My Reflectionを所持して開始。 | Isaac | Isaac | Suicide King | It Livesをアンロック |
| 8 | Cat Got Your Tongue | Guppy's Head, Guppy's Tail, and Guppy's Hairballを所持して開始。 射撃禁止。 Guppyの状態で開始。 |
Isaac | Mom | Rune of Algiz | Guppyに変身 |
| 9 | Demo Man | Dr. Fetus, Remote Detonator, Match Stickを所持して開始。 | Isaac | Mom's Heart | The Chaos Card | Dr. Fetusをアンロック |
| 10 | Cursed! | Yum Heart, Raw Liver, The Compass, Treasure Map, Blue Map, Child's Heartを所持して開始。 全ての通常部屋の出入口にトゲが付く。 トレジャールームあり。 |
Magdalene | Mom | Credit Card | Magdaleneをアンロック |
| 11 | Glass Cannon | Epic Fetus, Loki's Hornsを所持して開始。 | Judas | Satan | Rules Card | Epic FetusとLoki's Hornsをアンロック |
| 12 | When Life Gives You Lemons | Lemon Mishap, 9 Volt, Habitとピル(Lemon Party)を所持して開始。 | Isaac | Mom | A Card Against Humanity | なし |
| 13 | Beans! | Pyro, The Bean, The Black Bean, 9 Volt, Butt Bombsを所持して開始。 射撃禁止。 |
Isaac | Mom | Burnt Penny | なし |
| 14 | It's in the Cards | Deck of cards, Starter deck, The Batteryとランダムなタロットカード2枚を所持して開始。 | Isaac | Mom | SMB Super Fan | なし |
| 15 | Slow Roll | Polyphemus, My Reflection, Cupid's Arrowを所持して開始。 | Isaac | Mom | Swallowed Penny | なし |
| 16 | Computer Savvy | Technology, Technology 2, Spoon Benderを所持して開始。 | Isaac | Mom | Robo-Baby 2.0 | なし |
| 17 | Waka Waka | Strange Attractor, Anti-Gravityを所持して開始。 | Isaac | Mom | Death's Touch | なし |
| 18 | The Host | Spider Baby, The Mulligan, The Tickを所持して開始。 | Isaac | Mom | Technology .5 | なし |
| 19 | The Family Man | Brother Bobby, Sister Maggy, Dad's Key, BFFS!, Rotten Babyを所持して開始。 射撃禁止。 |
Isaac | Isaac | Epic Fetus | Dad's KeyとIt Livesをアンロック |
| 20 | Purist | 初期アイテム無し。（トレジャールームも存在しない） | Isaac | Mom's heart | Rune of Berkano | Momを1回撃破 |
